Preparation of antibody that commonly recognizes ZAKI-4 alpha and beta of human, rat and mouse

Abstract

ZAKI-4 has been identified as a thyroid hormone-responsive gene from cultured human skin fibroblasts. Recently, it has been reported that overexpressed ZAKI-4 or DSCR-1 (a product of a gene located in the Down Syndrome Critical Region) inhibits the calcineurin function by binding to the catalytic domain of calcineurin A subunit. Therefore, it has been hypothesized that ZAKI-4 plays a physiological role by inhibiting calcineurin activities. To prove that hypothesis it should be determined whether ZAKI-4 is expressed in calcineurin-expressing cells. For this purpose it has been planned to raise a specific antibody against ZAKI-4. A polypeptide that is conserved in two ZAKI-4 isoforms (alpha and beta) but not in DSCR-1 was used for immunization. Dot blot analysis using the antiserum showed that the antibody titer became detectable nine weeks after immunization and increased at 12 weeks. By Western blot analysis, and a band at about 36 kDa was detected in the mouse brain and heart but not in the liver. The neutralization of this antiserum with the polypeptide used for immunization resulted in reduced staining of the 36 kDa band, thus indicating that the anti-serum prepared in the present experiment can recognize ZAKI-4 protein.

ZAKI-4は、ヒト培養皮膚繊維芽細胞から甲状腺ホルモン反応性遺伝子として同定された。近年、ZAKI-4あるいはDSCR-1(ダウン症危険域にある遺伝子の産物)が過剰発現してカルシニューリンAサブユニットの触媒領域に結合することにより、カルシニューリンの機能を抑制すると報告されている。その結果、ZAKI-4がカルシニューリン活動を阻害することにより生理学的役割を果たしているという仮説が立てられている。この仮説を証明するためには、カルシニューリン発現細胞でZAKI-4が発現するか否かを確認する必要がある。このため、本研究ではZAKI-4に対する特異的抗体の作製を計画した。免疫形成には、ZAKI-4の2種のアイソフォーム(αおよびβ)にはあるがDECR-1にはないポリペプチドを使用した。抗血清を用いたドットブロット法では、抗体価は免疫形成の9週間後に測定可能となり、12週目で上昇した。ウェスタンブロット法では、マウス脳および心臓に約36kDaのバンドが認められたが、肝臓では認められなかった。この抗血清を免疫形成に使用したポリペプチドで中和したところ、36kDaバンドの染色反応が低下した。この結果は、本研究で作製した抗血清がZAKI-4蛋白認識可能であることを示している。