Clinorotation inhibits chondrogenesis in micromass cultures of embryonic mouse limb cells

Abstract

Studies of the response of mammalian chondrocytes to gravitational changes in vivo, in organ culture, and in cell culture show that chondrogenesis is reduced in microgravity or by unloading, and increased by low levels of excess g. To investigate the cellular responses to microgravity using a ground based model, micromass cultures were exposed to simulated weightlessness on two clinostats. For rotation on the large clinostat, cultures were set up in Rose chambers, and cells were videotaped and photographed at several time periods after rotation began. For the smaller clinostat, cultures were set up in T-flasks, and two axes of rotation for clinostated cultures were used. Stationary controls (+1 g, -1 g (upside-down), and sideways) as well as rotation controls were employed. Rotation rate was 30 rpm for both clinostatted cultures and rotation controls. Chondrocyte differentiation was assessed by cartilage specific alcian blue staining. Significantly fewer alcian blue stained nodules were present in clinostatted cultures than in stationary controls or rotation controls. Nodules that did not stain with alcian blue, probably due to unsulfated matrix were present in all cultures. The number of nodules in sideways controls was greater than in any other culture (108 percent of +1 g controls), probably due to ongoing stimulus of the cell via cytoskeletal components. The results show that chondrocytes in culture respond to changes in the gravity vector in a predictable manner, and that carefully controlled clinostat studies can be useful adjuncts to and predictors for spaceflight experiments.

軟骨形成が微小重力下あるいは無重力下では減少し、低レベルの過剰gにより増加することを、生体内、器官培養、細胞培養時における重力変化に対する哺乳動物軟骨細胞の反応の研究は示している。地上モデルを使用して微小重力に対する細胞の反応を観察するため、2つの植物回転器上で模擬無重力状態にし、微小塊培養をおこなった。大型植物回転器上の回転では、ローズチャンバー内で培養をおこない、細胞のビデオ録画と写真撮影を回転開始後数時間間隔でおこなった。小型植物回転器では、培養はT型フラスコでおこない、植物回転器による培養には2方向の回転軸を使用した。定位コントロール(+1g、-1g(上下)および横方向)と共に回転コントロールもおこなった。植物回転器による培養および回転コントロールいずれも回転速度は30回転/分でおこなった。軟骨特異的アルシアンブルー染色を使用して、軟骨細胞分化を決定した。植物回転器による培養でアルシアンブルーに染色される小塊数は、定位コントロールあるいは回転コントロールの場合に比べかなり少なかった。小塊がアルシアンブルーで染色されなかったのは、おそらく硫酸化されていない基質が全培養中に存在したためである。横方向コントロール中の小塊の数は、他のどの培養時よりも多いが(+1gコントロールの108%に相当)、これはおそらく細胞骨格成分を経由する細胞に対する継続した刺激によるものである。培養時の軟骨細胞が、予測どおりに重力方向の変化に反応していることと共に、注意深く制御した植物回転器による研究は、宇宙飛行実験に対する有効な手段であり予測に成りうることを本結果は示している。