レチノイン酸による初期原始線条期胚性外胚葉からの神経細胞の誘導的分化

Abstract

Retinoic acid has a strong teratogenic effect, as well as participates in embryonic development extensively. In previous studies, the mouse embryonic ectoderm at early primitive streak stage was cultivated in vitro, and it was found that most embryos differentiated to epithelial cells and fibroblasts, but did not seem to be committed to nerve cells. This study examined whether the embryonic ectoderm can differentiate to nerve cells in case of using Retinoic Acid (RA). The embryos were extracted from mice at early primitive streak stage, cultivated in medium with RA for 20 hours, then removed to RA-free medium. Cell differentiation was observed morphologically, and nerve cells were identified by immunohistological method using anti-neurofilament monoclonal antibodies. As a result, the differentiation of nerve cells was observed at the fifth day of cultivation, and this was identified immunohistologically. However, the number of differentiated nerve cells was not constant among each cultures.

強い催奇形成物質として知られ、脊椎動物中枢神経系の胚発生現象に広く関わっているレチノイン酸(RA)が、初期原始線条期の胚性外胚葉に作用することにより、神経細胞を高率に分化誘導することを確かめた。材料にはマウスを用い、前日の午後6時以後に成体雌雄を同居させ、腟栓が認められた日の午前2時を胎生0.0日とし、胎生6日の午後2時から8時に胚を取り出した。さらに詳細な発生段階の同定は、原始線条形成ならびに中胚葉翼の形成の程度によって行った。近位内胚葉を酵素的に剥離した後、胚性外胚葉の予定胚域にあたる腹方域のみを切りはずし培養した。培養胚細胞のRA処理にはAll-trans型レチノイン酸を用いた。培養開始から20時間後に、これらの培養細胞をF12培養液で3回洗い、RAあるいはDMSO(ジメチルスルホキシド)を十分取除いた後、ふたたび50％ラット血清入りF12培養液でさらに6日間培養した。細胞分化の同定には位相差顕微鏡による形態的観察を行うとともに、細胞を酸アルコールで氷冷固定した後、モノクローナル抗体による特異的染色性を、ストレプトアビジン蛍光免疫組織法を用いて判定した。観察の結果、RA処理後の胚性胚外葉の培養細胞はDMSOのみで処理されたコントロールと同様、培養2日目では上皮細胞様を呈し、その多くは多層細胞を形成したが、培養細胞群の中心域はほぼ2層の細胞層を維持していた。しかし3日目以降はRA処理培養細胞はコントロールとは異なる様相を示した。これらのデータから、中枢神経系の初期分化成立に内在性レチノイン酸が関わっている可能性、およびRA処理が未分化細胞の分化発現を誘導した可能性が示された。